实验方法学

发布时间：2014/2/7 16:47:10　浏览次数：58127　[字号：大 中 小]　 [关闭此页　打印此页]

 南京建成生物工程研究所

季建平教授主编

东南大学医学院病生教研室

 

一、肝素的配制：

市售肝素冻干粉140单位/mg，1克瓶装，每瓶140，000单位，称取0.1克肝素冻干粉，加生理盐水5ml，配成2800单位/ml。取50～100μl湿润管壁，可抗凝人血3～5ml，血液不会凝固。老鼠血易凝固，所以最好更浓一些。可以取0.1克肝素冻干粉，加3ml生理盐水溶解后，取50～100μl,可抗凝鼠血2～4ml。

肝素抗凝管的制备：取0.1克肝素冻干粉，加2.5ml生理盐水。取100μl～150μl滴入塑料或玻璃管中，湿润管壁，低于80℃小烤箱中（可以用烤面包的小烤箱），横向转动，每隔5～10分钟转动一次，直至干燥后放入4℃保存，可使2～5ml血液不凝固。

二、血液样本的收集：

全血根据收集的条件，分成不抗凝和抗凝两种。同时，不抗凝分离出的上层黄色的液体我们称之为血清；抗凝分离出的上层黄色的液体我们称之为血浆。

    1、不抗凝收集血清:将收集好的全血,静置1～2小时，直接低速离心分离出血清待用或保存。

2、抗凝收集血浆: 收集抗凝全血，轻轻颠倒充分抗凝后，可直接低速离心分离血浆(也可静置半小时左右再低速离心分离血浆)待用或保存。根据不同抗凝剂的性能特征，选择合适的抗凝剂。实验室常用的抗凝剂有肝素的各种盐、EDTA及枸橼酸钠。

选择抗凝的注意点：

①、每一份样本所加的抗凝剂的量要一致，同时所取的全血的量也要尽量一致;

②、收集抗凝全血后一定要轻轻颠倒，充分抗凝，防止部分血液未接触到抗凝剂而导致凝固;

       ③、抗凝全血收集的血浆相对较多（1ml抗凝全血能分离出0.4～0.5ml血浆）;

       ④、抗凝收集的血浆冷冻保存后，解冻时可能会出现絮状浑浊，如有则需要离心去掉浑浊后

用于测定。

    3、全血收集: 收集抗凝全血，轻轻颠倒充分抗凝后，可直接定量吸取全血，用冷双蒸水制备溶血液后用于不同指标的检测；也可定量吸取全血，转入EP管，低温冻存（温度越低越好），测定之前解冻并按比例加入冷双蒸水制成溶血液用于检测。

    4、红细胞收集：收集抗凝全血，轻轻颠倒充分抗凝后，直接离心弃掉血浆，留下层红细胞，加入3倍体积的生理盐水，轻轻颠倒混匀，500～1000转/分,离心10分钟，弃上清留沉淀红细胞,重复2～3次,至上清液无色为止（洗涤红细胞）。

      ①、直接定量吸取红细胞，按比例加入冷双蒸水制成溶血液待测；

②、定量吸取红细胞，转入EP管，立即低温冻存（温度越低越好），测定之前解冻，并按比例加入冷双蒸水制成溶血液用于检测(解冻后部分红细胞会破裂,因此样本冷冻保存之前必须进行定量)。

三、动物组织样本的前处理:

1、取组织块（0.1g～0.2g）在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，准确称重，放入匀浆管中。

2、按重量(g):体积(ml)=1:9的比例加入9倍体积的匀浆介质（推荐使用0.86%的生理盐水）于匀浆管中，冰水浴条件下,用眼科小剪尽快剪碎组织块。

3、匀浆的方式有多种：手工匀浆，机器匀浆，超声粉碎。

①、手工匀浆：将玻璃匀浆管置于冰水浴条件下，手动匀浆，30秒/次，间隔30秒，重复6～8次，制成10%的匀浆液。

②、机器匀浆：用机械式匀浆机（组织捣碎机或内切式匀浆机），8000～10000转/分，冰水浴条件下，10秒/次，间隙30秒，连续3～5次。（皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间）

③、超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用400安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。

镜检观察:取少量组织匀浆作涂片，显微镜下观察细胞是否破碎，若没有则可延长匀浆时间。

4、将制备好的10%匀浆液用普通离心机或低温低速离心机2500转/分左右,离心10～15分钟，取上清液进行测定.（测定相应指标的同时需测一下相应样本的蛋白浓度，总蛋白测试盒本所有售）

四、植物组织样本的前处理:

    1、匀浆介质：

一般采用磷酸盐缓冲液(0.1mol/L pH 7.4)或生理盐水（0.86%或0.9%）,客户可根据样本及测定指标的情况自行设定浓度,目的是保持样本的等渗环境。

2、组织匀浆液的制备：

①、手工匀浆：取组织块（0.2g～0.5g）在冰冷的匀浆介质中漂洗，滤纸拭干，准确称重，放入匀浆管中，按重量(g):体积(ml)=1:4的比例加入4倍体积的匀浆介质于匀浆管中，冰水浴条件下,用眼科小剪尽快剪碎组织块，将玻璃匀浆管置于冰水浴条件，手动匀浆，30秒/次，间隔30秒，重复6～8次，制成20%的匀浆液。

②、机器匀浆：取组织块（0.2g～0.5g）在冰冷的匀浆介质中漂洗，滤纸拭干，准确称重，放入匀浆管中，按重量(g):体积(ml)=1:4的比例加入4倍体积的匀浆介质于匀浆管中，冰水浴条件下,用眼科小剪尽快剪碎组织块，机械式匀浆机（组织捣碎机或内切式匀浆机），10000～15000转/分，冰水浴条件下，15秒/次，间隙30秒，连续3～5次，制成20%的匀浆液。

③、液氮研磨：取组织块（0.2g～0.5g）在冰冷的匀浆介质中漂洗，滤纸拭干，准确称重，放

入研钵中，用眼科小剪尽快剪碎组织块，加入液氮研磨至粉末状（研磨要迅速），加入匀浆

介质，充分抽提，制备成20%的匀浆液。

镜检观察:取少量组织匀浆作涂片，显微镜下观察细胞是否破碎，若没有则可延长匀浆时间。

匀浆上清液的制备：将制备好的20%匀浆液用普通离心机或低温低速离心机3500转/分左右,离心10～15分钟，取上清液进行测定（测定相应指标的同时需测一下相应样本的蛋白浓度，总蛋白测试盒本所有售）。

五、培养细胞的前处理：

1、培养液的测定：

   直接吸取培养液，2500转/分，离心10分钟，取上清液进行测定。

[注]：一般建议细胞密度在100万个/ml以上。

2、培养细胞的测定：

①、细胞沉淀的收集：

对于悬浮培养的细胞，通过离心收集细胞沉淀，将细胞悬液1000转/分，离心10分钟，弃上清留细胞沉淀。

对于贴壁培养的细胞，用胰酶将细胞消化下来加入培养基终止消化，或用细胞刮将细胞刮下来；制成细胞悬液，1000转/分，离心10分钟，弃上清留细胞沉淀。

[注]：一般建议收集的细胞数量在100万个以上。

②、细胞沉淀的洗涤：

在细胞沉淀中加入0.5～1ml的等渗缓冲液（推荐 0.1mol/L pH7～7.4磷酸盐缓冲液或生理盐水），轻轻颠倒混匀， 1000转/分，离心10分钟，弃上清留细胞沉淀，重复洗涤2～3次。

③、细胞匀浆液的制备：

在细胞沉淀中加入一定量的等渗缓冲液（等渗缓冲液的加入量根据所测指标的不同而有所改变，一般推荐加入0.5ml，细胞密度不小于100个/ml），混匀，将细胞悬浮于等渗缓冲液中。

[注]：等渗缓冲液推荐使用 0.1mol/L pH7～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水（0.86%或0.9%）

手动匀浆：用移液器将细胞悬浮液转移至玻璃匀浆管中（2ml玻璃匀浆管），将玻璃匀浆管置于冰水浴条件，手动匀浆， 1分钟/次，间隔30秒，重复6～8次，然后取破碎好的匀浆液进行测定（不离心）。

超声破碎：将细胞悬液置于冰水浴条下，超声破碎：功率300W， 3～5秒/次，间隔30秒，重

复3～5次；取破碎好的匀浆液进行测定（不离心）。

[注]：细胞破碎好以后取出部分匀浆液显微镜观察，如细胞还未破则增加重复次数；

测定相应指标的同时需测一下相应样本的蛋白浓度，总蛋白测试盒本所有售。

因为很多裂解液都是蛋白变性剂，因此如果老师测定的指标是酶相关的，一般不建议用裂

解液来裂解细胞。

3、培养液及细胞一起处理后测定：

对于悬浮培养的细胞直接进行破碎

对于贴壁细胞用细胞刮直接将细胞刮下来，制成细胞悬液以后进行破碎

[注]：一般建议收集的细胞密度在100万个/ml以上。

手动匀浆：用移液器将细胞悬液转移至玻璃匀浆管中（2ml玻璃匀浆管），将玻璃匀浆管置于冰水浴条件，手动匀浆，30秒/次，间隔30秒，重复6～8次，然后取破碎好的匀浆液进行测定（不离心）。

超声破碎：将细胞悬液置于冰水浴条下，超声破碎：功率300W， 3～5秒/次，间隔30秒，重复3～5次；取破碎好的匀浆液进行测定（不离心）。

[注]：细胞破碎好以后取出部分匀浆液显微镜观察，如细胞还未破则增加重复次数

测定相应指标的同时需测一下相应样本的蛋白浓度，总蛋白测试盒本所有售。

六、线粒体及微粒体的提取：

1、制备10%的组织匀浆（详见组织匀浆方式）

2、制备线粒体：取10%的组织匀浆，用普通离心机或低温低速离心机以1000～2000转/分,离心10分钟，弃沉淀，取上清液以8000～10000转/分（低温高速离心机）离心15分钟，沉淀物为线粒体。

3、胞浆部分：分离线粒体后的上清液即为胞浆。

4、制备微粒体：取分离线粒体后的上清液即胞浆，以144000g即40000转/分,离心30分钟，沉淀物为微粒体。

5、将分离的线粒体或微粒体分别用冰冷的匀浆介质制备成混悬液，用手工匀浆或机器匀浆使线粒体或微粒体破碎，或者用somiprep150型超声发生器以振幅14微米超声处理30秒，或者用国产超声波发生仪，400安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次，使线粒体或微粒体破碎，待测酶活力，也可用反复冻融的方法使其破碎，但有部分酶活力会受影响。

6、制备好的线粒体、微粒体、胞浆部分可根据您的需要分别进行各种测定。

 

七、线粒体的鉴定（中性红－詹纳斯绿B染色）：

在两张干净载玻片中央各滴2～3滴中性红—詹纳斯绿B染液，待其中的酒精蒸发完全后，用牙签挑少许沉淀物均匀涂布在一张玻片的染液中；另取上清液一滴，混于另一张玻片的染液中，两片分别盖上盖玻片，染色5分钟，在高倍镜下观察，被染成亮绿色颗粒即线粒体。

中性红－詹纳斯绿B染色的配制：

A液：取詹纳斯绿B（Jana’s green B）饱和水溶液（溶解度5.18%）3滴滴入5ml无水乙醇中，混匀。

B液：取饱和中性红（Neu－tral red）水溶液（10mg中性红溶于150ml蒸馏水中，并用黑纸包好贮冰箱）20～30滴滴入5ml无水乙醇中，混匀。

用时将A液和B液混和即成中性红－詹纳氏绿B染液（混和液中的染料不稳定会在24小时内发生沉淀）。

[注]：1、若发现涂片上有成团的染料可将詹纳氏绿B 3滴改成1滴或2滴，而将中性红20～30滴改为10～20滴。

2、本研究所线粒体制备方法较为成熟，一般不需要染色鉴定。

八、红细胞中SOD的抽提：

1、采集手指血、或肝素抗凝的静脉血或动脉血50µl[注1]，冲入盛有1～2ml的生理盐水的带刻度离心管中, 500～1000转/分,离心10分钟。

2、用微量移液器吸去上清液（要吸干净），留沉淀的红细胞。

3、加入预冷的双蒸水0.2ml，混匀（使红细胞溶解）。

4、加入95%乙醇0.1ml，振荡30秒。

5、加入三氯甲烷（氯仿）0.1ml置旋涡混匀器充分混匀（抽提）一分钟。

6、3500转/分 离心8分钟。

此时液体分三层：上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷。若上清有混浊可加入少量固体NaCl后再离心5分钟，即可澄清。

记录上清液体积，取5～20µl作SOD测定[注2]。

[注1]：大、小鼠可取内眦血，用玻璃毛细管从内眦部斜向咽喉方向刺入，或者剪尾取血，将血滴在含肝素并烤干的玻片上（烤干时温度要低于80℃），再用移液器取50µl血，作SOD抽提。血量少时可取10～20µl抗凝全血（做慢性动物试验，在饲养过程中可以反复取血5～6次）。

[注2]：哺乳动物红细胞中只有铜锌SOD，没有锰SOD。

九、红细胞膜的制备：

1、 原理和应用 ：

 哺乳动物细胞是生物质膜最方便，最经济的来源，除来源广泛以外，这种细胞还不含任何细胞器，从而可以得到一种纯净的细胞质膜。红细胞血影（ghost）膜主要是采用低渗透处理来获得的，在低渗介质中，红细胞膨胀，由双面盘状变成近乎球形，随后细胞内容物包括血红蛋白成分因细胞破裂而释放出来。最后，通过离心沉淀技术可获得纯净的红细胞膜（又称红细胞血影膜）。

2、 仪器和设备：常速离心机和低温高速离心机

3、 试剂(建成生物工程研究所可订购)

①、等渗缓冲液（本所有售）

②、低渗缓冲液（本所有售）

4、 实验步骤：

①、收集血液并洗涤红细胞：

将血液标本直接收集到已肝素化的容器内，立即在4℃离心（1500转/分，10分钟），用吸管吸去上清液并小心吸去压积红细胞上层的白色绒毛状膜成分（即白细胞等）。将压积红细胞用10倍体积的4℃等渗缓冲液或生理盐水悬浮，依照上述离心条件离心，如此重复2～3次，直至上清液无色，而且没有上层白色绒毛层，用吸管吸除上清液，保留压积红细胞。

②、制备细胞膜：

取压积红细胞，按1：10的比例加入低渗缓冲液，混合均匀，在4℃环境中放置20分钟，由于溶血，细胞悬液由鲜红色变成透明暗红色，（将此悬液对着日光灯看呈透明）。然后在低温高速离心机上平衡离心（20000g×30分钟，一般为8000～12000转/分×30分钟，4℃。），取出离心管可见底部有一块粉红色沉淀，小心吸去或倾斜离心管缓慢倒出暗红色上清液。沉淀部分再加入10倍体积的低渗缓冲液，混合均匀后重复离心（20000g×30分钟或8000～12000转/分离心30分钟，4℃）两次或三次，直至沉淀部分呈现乳白色，弃去上清及离心管底部褐色的纤维蛋白样沉淀斑，收集白色或浅粉红色血影膜。

③、血影膜的收集和保存：

将血影膜悬浮于一定体积的低渗缓冲液中，混合均匀，取少量样品用考马斯亮兰法或Lowry氏法或其他方法测定蛋白含量。按需要将血影膜用低渗缓冲液稀释成一定蛋白含量的悬液，定量分装到小容器中，分次使用从而避免膜样品反复冻融，在-20℃，-40℃，-70℃或液氮中贮存备用。

④、血影膜的鉴定：

细胞膜的生物化学性质可用乙酰胆减酯酶、Na+K+-ATP酶活性来鉴定；其形态特征可用相

差光学显微镜和透射电子显微镜来观察。

5、 注意事项：

①、红细胞可来源于人和其他哺乳动物（如大鼠、小鼠、猪、羊、牛、兔等），也可直接购买当地中心血库（或血液供应站）的全红细胞，后者可免除其他血细胞的干扰。

②、去除血红蛋白的程度不仅取决于溶血缓冲液的pH值，而且取决于缓冲液的渗透压。PH值过低，渗透压过高都会造成血红蛋白贮留，血影膜沉淀呈现粉红色。此外溶液中的二价离子浓度达1～5mmol/L时也会使红蛋与白明显贮留。细胞低渗溶血缓冲液的体积比应该在1：10左右，比例过大或渗透压过低则会增加非血红蛋白蛋白质的损失和膜的破裂，所以，要得到“完整的”无血红蛋白的膜则需要注意上述几点。

③、细胞和膜的贮存时间要依研究目的而定。通常，要尽快使细胞与血浆分离，并用等渗缓冲液或生理盐水洗涤。在50%的比容下，悬液能在4℃保存过夜，但应在24小时内使用。由于白细胞有较高的蛋白酶活性，对细胞的保存影响较大，因此在制备过程中应尽可能去除。细胞膜的制备应在当日内完成，4℃贮存细胞或细胞膜会使得非血红蛋白的蛋白质损失增加，冻存对细胞膜也是有损伤的，如果可能最好是在膜制备完成后就进行相应的检测，即使贮存也应该贮存于低渗缓冲液中，并尽快测试。

④、严格控制膜的洗涤次数，次数过多会使膜酶活性降低而影响其生化功能。

⑤、一般来说，其他哺乳动物红细胞（如牛、猪、狗、大鼠等）对低渗溶血的表现是相近的，但也不能简单地认为所有这些红细胞在形态学和生物化学性质等方面都是一致。

十、心肌细胞膜的制备：

1、试剂组成:

试剂Ⅰ液：蔗糖0.1M，EDTA2mM，咪唑1mM，pH7.4。

试剂Ⅱ液：尿素1.3M，咪唑12mM，EDTA 2mM，MgCl2·6H2O 0.1mM，(NH4)2SO47.6mM，pH7.4。

试剂Ⅲ液：咪唑25mM，组氨基酸125mM，EDTA 13µM，pH 6.8。

试剂Ⅳ液：咪唑25mM，组氨基酸50mM，EDTA 0.3µM，pH 6.8。

2、操作方法：

①、将实验动物击昏处死后，迅速取出心脏，放入冰冷的生理盐水中洗净血液，滤纸吸干水分。

②、10%匀浆滤液的制备：取左心室前壁心肌，去掉心内、外膜，称重（1克左右），加入9倍的Ⅰ液，在冰浴中剪碎，匀浆，二层纱布过滤。

③、将滤液以10000转/分 离心20分钟。

④、在沉淀物及心肌细胞膜中加入5ml试剂Ⅰ洗两次（每次均需以10000转/分 离心20分钟）。

⑤、在沉淀物心肌细胞膜中加10ml试剂Ⅱ混匀后于0℃放置48小时。

⑥、将沉淀物混悬液以10000转/分离心 20分钟，然后将沉淀物用试剂Ⅲ洗两次。

⑦、将沉淀物即心肌细胞膜悬于约10ml试剂Ⅳ中，置0℃中保存，于48小时内测ATP酶活性。

十一、血小板的分离：

1、血小板的分离方法一：

①、硅化管的制备：

将硅油与石油醚按3：97的比例配制，取适量于10ml玻璃管内，转动玻管，使硅油均匀地涂布于玻璃管内壁，把每只玻管内的硅油稍倒干净后放入烤箱，200℃烤1.5～2小时。

也可直接用干净的塑料管来代替硅化管，不需进行硅化。

②、血小板的制备：

a、取抗凝全血收集在硅化管内或塑料管内。

b、800转/分 离心10分钟。

c、取上层血浆于硅化管或塑料管中，以3000转/分 离心10分钟。

d、弃去上层血浆，管底沉淀物即为血小板。

e、用生理盐水洗三次，每次以3000转/分 离心10分钟，去上清留沉淀。

[注]：分离血小板时所有的玻管及滴管均要硅化，或用塑料试管或塑料滴管。

2、血小板分离方法二：

①、将抗凝全血收集在硅化玻璃管或塑料管内，用生理盐水，或者Han’s液或含EDTA的缓冲液作等体积稀释，混匀。

②、取淋巴细胞分离液 2ml，置10ml圆底试管中（分离血小板的玻璃试管均要硅化，或用塑料管及塑料滴管）

③、用滴管将稀释血沿管壁徐徐铺于分离液界面上，注意勿冲破界面。

④、以2000转/分 水平离心15分钟，取出，可见试管内分四层，第一层为含血小板的血浆层；第二层很薄，是白雾状或白絮状，为白细胞层；第三层为分离液层；第四层为红细胞层。

⑤、用尖毛细滴管直接沿管壁吸取第一层富血小板的血浆层，注入硅化玻璃管或塑料管内。

⑥、以3000转/分，离心10分钟，将上层血浆倒去，管底沉淀物即为血小板。

⑦、用生理盐水或含EDTA的溶液清洗2～3次（每次3000转/分 离心10分钟），弃上清留沉淀反复2～3次。

⑧、将血小板记数后备用。

 

 

 

 

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细胞爬片制备详细过程